Analysez vos données d’RNA-seq ciblé

Nouveau pipeline pour l’analyse de données RNA-Seq ciblé (capture) avec recherche des gènes de fusion, mutations et analyse du splicing.

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SomaRNA™

Contexte

Gènes hybrides formés de deux gènes précédemment indépendants, les gènes de fusion résultent de réarrangements chromosomiques tels que les translocations, les délétions ou encore les inversions.

Les transcrits résultants de ces réarrangements sont impliqués dans divers types de cancers [1], étant plus susceptibles de conduire à la production de protéines anormales. Ainsi, la plupart des gènes de fusion identifiés à ce jour sont associés à des cancers hématologiques, sarcomes mais aussi carcinomes [2]. Les identifier est donc un enjeu primordial dans l’identification de cibles thérapeutiques.

Par exemple, les fusions de gènes codant pour des tyrosines kinases représentent une classe importante d’oncogènes associés aux tumeurs hématologiques et solides. Ils sont produits par des translocations et d’autres réarrangements chromosomiques d’un sous-ensemble de gènes de tyrosines kinases.  Il a été montré que les inhibiteurs de tyrosine kinase étaient particulièrement efficaces dans le traitement de ces types de cancers [3].

Nouveautés

Nous avons créé SomaRNA, un outil dédié à l’analyse de données de RNA-seq issues d’approches ciblées de type capture, permettant entre autres d’identifier et visualiser les événements de fusions de gènes à l’échelle du transcrit, tout en détectant SNV et indels.

Ce dernier est disponible au lancement d’une analyse si le type de données du projet a été défini comme ARN à sa création.

Comment ça marche ?

La détection et la visualisation des fusions par SomaRNA repose sur la combinaison de deux outils :

  • STAR, un aligneur de données RNA-seq conçu pour l’alignement de séquences non contiguës directement sur le génome de référence [4] ,
  • Arriba, qui détecte les fusions de gènes à partir d’alignements chimériques [5].

A partir des alignements chimériques issues de STAR, Arriba applique un ensemble de filtres pour éliminer les artéfacts connus et les transcrits observés en contexte non-pathologique. Il associe à chaque événement de fusion potentiel un score de confiance, lequel dépend de multiples critères :

  • le nombre de séquences supportant la fusion,
  • l’équilibre entre les split reads et les paires de reads discordantes,
  • la distance entre les breakpoints, leur position (intragénique ou non),
  • le type d’événement.

Le résultat final est une liste de prédictions de fusions, que l’interface propose sous la forme de différents onglets :

Informations générales sur la fusion, telles que le nombre de spanning reads couvrant la fusion, sa nature (translocation, duplication, inversion or délétion) et son impact sur le cadre de lecture.

Informations relatives aux partenaires, avec les symboles des gènes impliqués dans l’événement de fusion et, pour chacun, les exons impliqués à l’échelle du transcrit ainsi que les coordonnées génomiques du point de fusion.

Représentations graphiques de la fusion, aussi bien à l’échelle du gène et de l’exon, que de la protéine. 

Un premier onglet présente la structure de la fusion et les partenaires impliqués, la couverture des exons couverts par le manifeste de l’analyse étant représentée sous la forme d’un diagramme sur fond jaune :

Les domaines protéiques conservés à l’issue de la fusion  sont mis en évidence dans une seconde vue, pour permettre l’identification de cibles thérapeutiques potentielles :

Autres fonctionnalités

SomaRNA contient une étape de détection des variants à l’issue de l’alignement de STAR, via le variant caller Freebayes.

A l’instar des worksets SomaVar et GermlineVar, ces variants sont ensuite annotés et rendus disponibles dans un onglet Variants.

A venir 

Cette première itération du workset ARN sera bientôt complémentée par des modules dédiés à l’expression ainsi qu’à la détection des sites d’épissage alternatifs.

Durant la phase beta de cette fonctionnalité, n’hésitez-pas à nous faire part de vos retours par mail à l’adresse support@seq.one.

Biblioraphie

[1] Yoshihara, K., Wang, Q., Torres-Garcia, W., Zheng, S., Vegesna, R., Kim, H., and Verhaak, R.G.W. (2015). The landscape and therapeutic relevance of cancer-associated transcript fusions. Oncogene 34, 4845–4854.

[2] Mitelman, F., Johansson, B., and Mertens, F. (2007). The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nat. Rev. Cancer 7, 233–245.

[3] Medves, S., and Demoulin, J.-B. (2012). Tyrosine kinase gene fusions in cancer: translating mechanisms into targeted therapies. J. Cell. Mol. Med. 16, 237–248.

[4] Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, Drenkow J, Zaleski C, Jha S, Batut P, Chaisson M, Gingeras TR. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 2013;29:15–21

[5] https://github.com/suhrig/arriba

Améliorations bionformatiques du pipeline SomaVar amplicon

A travers une meilleure gestion des séquences chevauchantes et des amorces d’amplification, nous avons amélioré le calcul des fréquences alléliques lors de l’analyse de données amplicons avec SomaVar.

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Nous avons retravaillé le pipeline SomaVar amplicon afin d’améliorer ses performances sur le calcul de la fréquence allélique des variants (VAF). Ces modifications n’affectent pas la capacité de détection du pipeline (variant calling), mais permettent de corriger le calcul de la VAF dans les régions :

  • de chevauchement entre les séquences paired-end,
  • couvertes par des séquences correpondant en partie aux amorces de PCR d’un ou plusieurs amplicons.

Nouveautés

Gestion des séquences chevauchantes : chaque amplicon correspondant à un seul produit de PCR, les portions chevauchantes entre les R1 & R2 à l’issue de séquençage paired-end correspondent à la même information. Afin de corriger l’augmentation artificielle de la couverture locale qui résulte de ces situations de chevauchement, notre pipeline inclut désormais une étape de sélection d’une des séquences sur la base de sa qualité.

Gestion des amorces d’amplification : un bon design implique souvent que les amplicons se chevauchent et, potentiellement, que cette région de chevauchement couvre une des amorces d’amplification si celle-ci n’a pas été éliminée des séquences. Celle-ci peut donc résulter en un faux positif, si une mutation est présente dans la séquence des amorces, ou diluer la fréquence d’un variant.

Nous proposons désormais une étape facultative de soft-clipping sur une longueur fixe de 20 paires de bases à chaque extrémité des séquences, éliminant ainsi ces portions de séquences des étapes bioinformatiques ultérieures (alignement, variant calling).

Retrocompatibilité

Une étape de soft-clipping de 20 paires de bases était prévue par défaut dans la version précédente du workset SomaVar. Cependant, pour tous les projets de panels amplicons déjà créés, l’effet n’est pas rétroactif et toute nouvelle analyse lancée le sera sans soft-clipping des amorces.

L’élimination des séquences des amorces étant prévue dans certains kits, notamment les kits Ampliseq (Illumina), cette étape de soft-clipping est devenue facultative et paramétrable à la création du projet.

Nouvel outil d’analyse des CNV en contexte somatique

Nouveau pipeline et nouvelle interface d’interprétation pour l’analyse des CNV dans les panels de capture somatique. Le pipeline à été testé et validé avec des échantillons FFPE !

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Un workset dédié à l’analyse de CNV à partir de données de panels de gènes en contexte somatique fait son entrée sur SeqOne. Si la bioinformatique sous-jacente est similaire au pipeline CNVCapture déjà disponible pour l’analyse de variants constitutionnels, ce nouvel outil présente quelques spécificités qui vont être détaillées dans les paragraphes suivants.

Nouveautés

Des paramètres adaptés au contexte somatique. A l’instar du workset CNVPanel, la procédure de sélection des contrôles au sein de la cohorte s’appuie sur la combinaison de scores de corrélation, suivie de l’élimination des outliers.

Cependant, en raison de la complexité des échantillons tumoraux, les seuils utilisés pour définir ces échantillons contrôles au sein de la cohorte sont plus permissifs, autorisant un score de corrélation plus faible (à 80%) et un degré de variation inter-individuelle plus élevé (maximum 30 %).

Une nouvelle visualisation à l’échelle du gène. La résolution des CNV est ici donnée à l’échelle du gène, représenté sous la forme d’un bloc dans lequel :

  • La couleur est donnée en fonction du statut du gène (gain ou délétion).
  • Le Z-score ayant été utilisé pour déterminer ce statut y est reporté ainsi que le nombre moyen de copies ou le génotype observé, selon que le variant est un gain ou une perte de copie(s).
  • Le pourcentage de régions du gène affectées par la variation, ou chunk ratio, est visible sous la forme d’un pourcentage (voir ci-dessous).
Détail du bloc représentatif d’un gène

Comment ça fonctionne ?

Le statut du gène (amplification, délétion ou normal) est là-encore défini par le biais de la région, ou chunk, présentant le Z-score le plus élevé en valeur absolue. C’est ce Z-score qui déterminera le Z-score associé au gène.

Une nouvelle statistique calcule le nombre de chunks à l’échelle du gène partageant le même statut que le gène dans son ensemble, et le seuil de ce ratio peut être modulé par l’utilisateur au moyen d’un filtre à partir de l’interface.

Interface de visualisation des CNV et filtres associés

Utilisation

Le workset SomaCNVCapture est disponible lors du lancement d’une nouvelle analyse, à partir d’un projet de capture de panel de gènes.

Il nécessite l’analyse conjointe d’un minimum de 8 échantillons.

Cette fonctionnalité n’est pour l’instant pas disponible pour les données amplicons.

Durant la phase beta de cette fonctionnalité, n’hésitez-pas à nous faire part de vos retours à l’adresse support@seq.one.

Annotation des variants multinucléotidiques (MNV)

SeqOne identifie les variants multi-nucléotidiques (MNV), une classe de mutations se traduisant par une succession de substitutions au sein d’un même haplotype. Jusqu’ici décomposés en multiples variants d’un seul nucleotide, ces variants seront désormais correctement annotés lors qu’ils affectent un même codon.
Cette implémentation concerne aussi bien les pipelines GermlineVar que SomaVar.

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Contexte

Les variants multi-nucléotidiques, ou MNV (pour multinucleotide variants) se définissent comme une succession de SNV (single nucleotide variant) au sein d’un même haplotype, et sont une classe de variation génétique biologiquement importante, bien que leur impact fonctionnel et leur mutagénèse soit encore largement inexplorés. 

Cela est en partie dû au fait que la plupart des pipelines d’analyses bioinformatiques utilisées pour déterminer l’impact fonctionnel des variations génétiques décomposent ces variants multiples et les annotent en tant que SNV distincts [1].

Cependant, lorsque deux variants constituant un MNV affectent le même codon, ce qui est fréquemment le cas, les interpréter indépendemment peut conduire à une prédiction erronée de leur impact au niveau de la protéine codée, et un mauvais diagnostic [2].

Exemple d’un MNV dont l’effet prédit diffère de celui des SNV qui le composent.

Nouveautés

SeqOne tire désormais partie du nombre grandissant de MNV identifiés et annotés dans les bases de données, en particulier celle de l’Exome Aggregation Consortium (ExAc). On y dénombre à ce jour plus de 5000 MNV, dont certains sont situés dans des gènes associés à des maladies [3].

Comment ça marche ?

L’étape clé dans la détection et l’annotation de ces variants est la normalisation qui survient à l’issue de l’étape de variant calling. Au cours de celle-ci, chaque variant est normalement réduit à sa représentation la plus simple dans le fichier VCF, afin d’obtenir une liste de mutations à injecter dans des bases de données externes d’annotation.

Désormais, les MNV potentiels sont identifés sur la base de leur position génomique dès l’étape de normalisation. Le choix de l’annotation pour ces variants dépend de leur effet prédit sur la protéine.

MNV codants. Lorsque plusieurs variants affectent le même codon (MNV codant), SeqOne compare les prédiction d’effet du variant multiple et de chaque variant individuel suite à l’étape d’annotation des variants. Si cet effet diffère, le MNV est reporté dans le tableau de variants, sinon le choix de la forme (simple, mutiple) conservée dépend de l’occurence du variant dans la base de données ClinVar.

MNV non-codants. C’est la version décomposée de ces variants et leurs annotations respectives qui sont proposées dans l’interface SeqOne.

L’information du potentiel MNV auquel ces variants appartiennent est tout de même conservée dans le fchier VCF annoté généré par notre pipeline, lequel peut être téléchagé depuis les résultats de l’analyse.

Bibliographie

[1] Sandmann, S., de Graaf, A.O., Karimi, M., van der Reijden, B.A., Hellström-Lindberg, E., Jansen, J.H., and Dugas, M. (2017). Evaluating Variant Calling Tools for Non-Matched Next-Generation Sequencing Data. Scientific Reports 7, 1–12.

[2] Wang, Q., Pierce-Hoffman, E., Cummings, B.B., Karczewski, K.J., Alföldi, J., Francioli, L.C., Gauthier, L.D., Hill, A.J., O’Donnell-Luria, A.H., Genome Aggregation Database (gnomAD) Production Team, G.A.D. (gnomAD) C., et al. (2019). Landscape of multi-nucleotide variants in 125,748 human exomes and 15,708 genomes. BioRxiv 573378.

[3] Lek, M., Karczewski, K.J., Minikel, E.V., Samocha, K.E., Banks, E., Fennell, T., O’Donnell-Luria, A.H., Ware, J.S., Hill, A.J., Cummings, B.B., et al. (2016). Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature 536, 285–291.

Panel in silico: de la gestion des manifestes et transcrits

Filtrez sur le panel in-silico ainsi que la liste de transcrits de votre choix avant même de visualiser vos variants et votre analyse de couverture.

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Nouveautés

Le mode de gestion des manifestes et des transcrits utilisés pour filtrer vos données a été revu et amélioré. Ce filtre s’applique aussi bien à votre tableau de variants qu’au module de visualisation de la couverture Gene coverage, vous permettant désormais de limiter l’affichage des résultats à vos seules régions génomiques et listes de transcrits d’intérêt.

Comment ça marche ?

A partir du rapport qualité de chaque analyse, un menu déroulant vous permet de sélectionner un panel in silico et/ou une liste de transcrits de référence parmi les fichiers importés sur votre entité, et ce avant même d’accéder au tableau de variants ou à l’onglet Gene coverage.

Interface de sélection d’un panel in silico et d’une liste de transcrits

Rappel : vous pouvez importer vos manifestes et listes de transcrits sous forme de fichier tabulaires depuis vos paramètres utilisateurs.

Utilisation

Ce système vous permet de restreindre la recherche de variants à différents groupes de gènes ou de transcrits en fonction de votre question biologique : recherche de facteurs de risque, de variants diagnostiques, ou de variants de pharmacogénomique.

En plus de vous faire gagner en précision et en rapidité, l’application de ces filtres en amont de l’interprétation permet de limiter les risques de conflit éthique et moral lié aux découvertes fortuites dans le cadre du diagnostic.

A French start-up harnesses the power of the latest generation genomic sequencers to dramatically increase COVID 19 testing capacity

SeqOne Genomics, a start-up specialized in genomic analysis software, is partnering with leading medical testing labs to develop an approach that delivers up to 100 times more COVID 19 tests per machine thanks to NGS sequencers.

Montpellier: May 1st, 2020: Epidemiological experts agree that the key to successfully managing the COVID 19 pandemic is a robust national testing capability that can dispense hundreds of thousands of tests per day.  Yet governments have struggled to ramp their testing capabilities to meet this vital objective. The cause of the testing shortfall is that the most reliable tests involve identifying the genetic signature of the virus using a mature qPCR technology that can only process a small number of tests per machine.  Clearly, satisfying the need for high volume national COVID-19 testing will require innovative new approaches that can scale to deliver substantially more tests than existing qPCR technology.  

SeqOne Genomics, a French start-up specialized in genomic analysis software, is developing a new approach to testing that could achieve this objective.  The approach takes advantage of the power of the latest generation of high throughput NGS sequencers to deliver tens of thousands of tests at a time.  To harness the power of these new machines, the company has developed software that incorporates concepts seen in academic publications in areas including multiplexing and extraction-free sequencing to allow large numbers of patient samples to be pooled together for analysis while keeping track of each individual’s results.  “Using NGS sequencers made sense both because of their power and availability,” said Nicolas Philippe, CEO of SeqOne Genomics. “We focused on developing a software solution that made it possible to use them to deliver high volumes of tests in a clinical environment” 

The concept has been successfully tested in the lab showing accuracy comparable to qPCR tests.  The approach offers the added benefit of providing information on an infected person’s viral load which can help optimize treatment strategies and better understand the disease from an epidemiological perspective.  Supported by the French government, SeqOne is now working with some of France’s largest medical testing labs and computing infrastructure providers to implement the concept nationwide.   

With implementation in France underway, SeqOne is now turning its sights on other countries and markets that might benefit from a cost-effective way to increase their testing capabilities.

About SeqOne: SeqOne develops state-of-the-art genomics analysis tools for clinical applications in the fields of cancer and rare disease. Its flagship product, SeqOne | Platform is a cloud-based end-to-end solution that dramatically reduces the turnaround time and cost required to deliver accurate genetic analyses for use in mainstream medicine.  In the short time since it has launched its platform secured a wide user base in a diver range of healthcare establishments including hospitals and private sector testing labs. It has won numerous awards including the prestigious iLab award and the ARC cancer foundation’s Hélène Stark prize. SeqOne is supported by the SATT AxLR and the Montpellier BIC incubator.