SeqOne étend son répertoire de variants structuraux

Vos worksets GermlineVar et SomaVar intègrent un nouvel outil, permettant la détection de variants structuraux jusqu’à 300bp.

Newsletter Février 2021

Le défi des variants structuraux

Les variants structuraux (SV) sont un type important de variation génétique, dont l’impact sur  la diversité phénotypique n’est pas negligeable [1]. Générallement définis comme des insertions, délétions, duplications, inversions ou translocations de 50bp ou plus [2], ils jouent un rôle dans le développement de nombreuses maladies, y compris celui de certains cancers. 

Représentation schématique de quelques variants structuraux

Bien que moins courants que d’autres formes de variations telles que les polymorphismes mononucléotidiques (SNP), les variants structuraux sont susceptibles d’altérer de manière drastique la fonction des gènes au sein desquels ils surviennent. Ils restent cependant largement moins étudiés que ces derniers, principalement en raison de la difficulté à les détecter.

Identifier les SV à partir des données de NGS

Chaque type de SV se caractérise par un profil spécifique à l’issue de l’alignement des séquences. Un alignement qu’ils perturbent bien souvent, en particulier à l’issue de séquençage dit short reads : lorsque les SV sont d’une magnitude équivalente ou supérieure à celle d’un read de séquençage, il devient difficile sinon impossible d’aligner correctement les séquences au génome de référence. Ces profils caractéristiques sont cependant autant de signatures pouvant être exploitées pour les détecter [2].

  1. Une profondeur de couverture variable. 

Ce critère est principalement utilisé dans la détection des CNV, et peut suggérer la présence d’autres types de réarrangements telles que les fusions de gènes, sans toutefois fournir d’indication précise quant aux coordonnées génomiques exactes des points de fusion.

Retrouvez plus d’informations sur la détection des CNV en contexte constitutionnel et somatique sur SeqOne.

  1. Des paires de séquences discordantes. 

Lors de séquençage paired-end, les paires de séquences dont l’orientation ou la position sont innatendues, peuvent permettre d’inférer la présence d’un SV, tout en restant imprécis quant à ses coordonnées génomiques exacts (le point de cassure n’étant pas directement séquencé).

  1. Des split reads. 

A l’issue de l’alignement par des outils tels que BWA, certaines séquences ne sont alignées que partiellement au génome de référence. La fraction non-alignée de ces séquences est alors masquée par un processus appelé soft-clipping. Lorsque la fraction non alignée d’une séquence est suffisamment longue pour pouvoir être alignée de manière non ambigue en d’autres coordonnées génomiques, on parle de split-reads. Ces séquences chevauchant par définition le point de cassure, elles permettent de déterminer de manière précise ses coordonnées génomiques. 

Un module dédié dans vos pipelines SeqOne

Nous avons ainsi intégré aux pipelines bioinformatiques GermlineVar et SomaVar le SV caller GRIDSS, lequel tire non seulement partie des signatures mentionnées ci-dessus, mais également de toutes autres séquences présentant du soft-clipping, des indels, ainsi que les paires de reads partiellement alignées, qu’il réassemble à l’échelle du génome en amont du variant calling [3]. L’ajout de cet outil étend le répertoire des variants détectés par nos pipelines, en y incluant désormais les SV jusqu’à 300bp.

Ce module vient complémenter nos outils de détection des insertions d’éléments transposables ou encore de gènes de fusion.

Références

[1] Sudmant, P.H., Rausch, T., Gardner, E.J., Handsaker, R.E., Abyzov, A., Huddleston, J., Zhang, Y., Ye, K., Jun, G., Fritz, M.H.-Y., et al. (2015). An integrated map of structural variation in 2,504 human genomes. Nature 526, 75–81.

[2] Alkan, C., Coe, B.P., and Eichler, E.E. (2011). Genome structural variation discovery and genotyping. Nat Rev Genet 12, 363–376.

[3] Cameron, D.L., Schröder, J., Penington, J.S., Do, H., Molania, R., Dobrovic, A., Speed, T.P., and Papenfuss, A.T. (2017). GRIDSS: sensitive and specific genomic rearrangement detection using positional de Bruijn graph assembly. Genome Res 27, 2050–2060.

Gestion plus complète des UMI en contexte somatique

Tirez-partie des UMI de manière optimale en sélectionnant l’un des 3 nouveaux modes d’analyses de SomaVar, et grâce à un rapport QC repensé et plus complet.

Newsletter Février 2021

Introduction

Etape incontournable de la plupart des protocoles NGS, tant pour la préparation des librairies que leur enrichissement en cibles d’intérêt, la PCR génère pour chaque molécule unique un nombre variable de clones, ou duplicats. 

Or cette étape est connue non seulement pour engendrer certains biais, amplifiant préférentiellement certaines séquences et augmentant ainsi artificiellement la couverture d’une position donnée dans le génome, mais également des erreurs qui peuvent s’avérer problématiques lors de la recherche de variants de très faible fréquence allélique.

Le recours à un index moléculaire unique (UMI, également connu sous le nom d’identifiant moléculaire unique) dans le workflow de prépration du séquençage, en amont de la PCR, offre une solution à ces problèmes. Ces UMI permettent à l’issue du séquençage d’identifier les séquences provenant d’une même molécule intiale, et ainsi de renforcer la précision du séquençage en éliminant les erreurs [1].

Avantages du recours aux UMI

Ceci présente deux avantages majeurs :

  • Une estimation plus précise de la fréquence allélique, en améliorant le processus de déduplication.

Au cours du pipeline d’analyse bioinformatique, les duplicats de PCR sont identifiés lors de l’étape de déduplication : les lectures s’alignant exactement à la même position dans le génome de référence étant identifiées comme autant de clones d’une seule et même molécule initiale. Une seule de ces séquences est alors retenue comme représentative de la molécule de départ pour la suite du pipeline.

Cependant deux séquences aux coordonnées génomiques identiques pourraient tout aussi bien provenir de deux séquences distinctes, issues de cellules différentes. Avec une approche de déduplication classique, celles-ci seraient réduites à une seule molécule pendant le processus de déduplication C’est donc autant de signal perdu pour la détection des variants, en plus de n’être qu’une représentation partielle du signal à cette position.

Lorsque chaque molécule est indexée en amont de l’amplification par PCR, de sorte que chacun clone puisse-t-être associé à la moculécule initiale, des séquences identiques à l’issue de l’alignement, mais provenant de molécules distinctes seront associées à des UMI différents.

  • Une sensibilité accrue pour identifier les variants de faible fréquence.

Les multiples clones de PCR peuvent être utilisés pour augmenter la qualité de la séquence représentative du fragment d’ADN d’origine. Puisque le fragment a été dupliqué avant le séquençage puis séquencé plusieurs fois, les multiples copies peuvent être utilisées pour corriger les erreurs de séquençage. En générant une séquence consensus à partir de ces duplicats, lequel repose sur un vote à la majorité pour chaque position, on peut alors éliminer en grande partie ce bruit de fond.

Cette application devient alors particulièrement utile lors de la recherche de variants de très faible fréquence allélique, lors du séquençage d’ADN tumural circulant (ADNct) par exemple, pour laquelle les erreurs générées lors de la PCR ou du séquençage peuvent rapidement devenir problématiques.

Utilisation sur SeqOne

En pratique, plusieurs modalités de traitement des UMI sont proposées sur la plateforme lors du lancement d’une analyse SomaVar :

  1. Standard mode (mode recommandé) : des consensus sont générés à partir des duplicats de PCR portant le même UMI, lorsque leur nombre est supérieur ou égal à 2. Les UMI représentés par une seule séquence (singletons) sont également conservés.
  2. High quality : les consensus sont générés à partir des duplicats de PCR portant le même UMI lorsque leur nombre est supérieur à 3, et les UMI supportées par 1 (singletons) ou 2 reads sont éliminés de l’analyse. Ce mode d’analyse est également plus stringent sur la qualité des bases à l’issue de la génération du consensus, et permet la détection de variants dont la fréquence allélique est inférieure à 1%. Il est recommandé lorsque la profondeur de séquençage est supérieure à 5000X, et pour des applications telles que le séquençage d’ADNtc.
  3. UMI disabled : les UMI ne sont pas utilisés pour la déduplication, et ceux-ci sont coupés de l’extrémité des séquences en amont de l’analyse.

Le rapport quality control de l’analyse SomaVar offre désormais une vue plus détaillée de la composition de l’échantillon, en particulier de la distribution des UMI selon le nombre de séquences qui les portent. Cette meilleure représentation de l’échantillon permet d’orienter le choix du mode d’analyse le plus approprié.

Distribution des UMI en termes de nombre de séquences au sein d’un échantillon.

Analyse des CNV

Vous souhaitez détecter les CNV à partir de vos données de capture avec UMI ? Le pipeline SomaCNVCapture sera désormais disponible dans vos projets UMI également. 


Quelle que soit la configuration sélectionnée lors du lancement de vos analyses SomaVar dans ce projet, l’analyse des CNV reposera sur une approche standard : des séquences consensus seront générées à partir des duplicats de PCR porteurs d’un même index, et les singletons seront conservés

Limitations actuelles et rétrocompatibilité

  • Seuls les kits suivants sont actuellements supportés sur la plateforme SeqOne :

– QIAGEN QIAseq 

– Agilent XTHS/Low input

– Agilent XTHS V2

– IDT xGen UDI-UMI

Si vous utilisez un autre protocole, contactez-nous !

  • Seul les worksets SomaVar et SomaRNA sont compatibles avec les données UMI.
  • Chacune des deux nouvelles configurations UMI (standard, high quality) présente des différences avec l’implémentation actuellement disponible pour SomaVar v1.4, résumées dans le tableau suivant :
SomaVar v1.4UMISomaVar v1.5 UMI standardSomaVar v1.5 UMI high quality
Nombre minimal de reads par consensus223
Qualité minimale de chaque base dans le consensus (score phred)303040
Reads hors consensus filtrésouinonoui

Bibliographie

[1] Kou, R. et al. Benefits and Challenges with Applying Unique Molecular Identifiers in Next Generation Sequencing to Detect Low Frequency Mutations. PLoS One 11, e0146638 (2016).

Alignements multiples dans votre genome browser intégré

La visualisation IGV integrée sur SeqOne gagne en flexibilité, vous permettant désormais d’afficher de multiples alignements dans une même fenêtre.

Newsletter octobre 2020

Un affichage modulable dans IGV

Afin de fluidifier la navigation sur la plateforme SeqOne, et en particulier la visualisation des variants dans le genome viewer intégré, nous avons entrepris de générer un alignement allégé, centré autour des variants de chaque échantillon, à l’issue des pipelines d’analyse GermlineVar, GermlineFamily, SomaVar et SomaDuo.

Représentation schématique de la génération du bam échantillon minimal

Dans la pratique, chaque échantillon dispose désormais de deux fichiers bam associés :

  • le fichier d’alignement brut, disponible au téléchargement depuis l’onglet Files.
  • le nouveau fichier bam dit “minimal”, ou min.bam, généré à la fin de l’analyse bioinformatique et à destination d’IGV.

De plus, le genome viewer intégré gagne en flexibilité, et permet désormais l’alignement de multiples fichiers bams. Ceux-ci peuvent aussi bien être les alignements d’échantillons différents à la même position à des fins de comparaison, ou bien le même échantillon (alignement brut, ou généré par une autre analyse).

Utilisation

A partir de la page variant, une icône d’options sur l’onglet Genome browser vous permet d’accéder au menu de paramétrage des alignements (Tracks settings).

Détail des options disponibles dans le genome browser

L’ensemble des projets et échantillons de votre compte sont alors disponibles à la sélection à partir de menus déroulants.

Enfin, il est possible de sélectionner le bam souhaité parmi ceux générés pour l’échantillon, qu’il s’agisse de son alignement brut (noté sample BAM file) ou du fichier généré par le dernier pipeline lancé sur l’échantillon (noté BAM from latest analysis).

Menu de sélection de l’alignement à ajouter dans la fenêtre Genome browser

Masquez sélectivement certains variants

La fonctionnalité deja vu vous permet de sélectionner des mutations dans votre tableau de variants afin de les masquer.

Newsletter octobre 2020

Nouveauté

L’analyse bioinformatique de données NGS obtenues sur un large panel de gènes ou un exome peut délivrer un nombre important de variants, qu’il convient ensuite de filtrer pour identifier la ou les mutations responsable(s) d’une pathologie.

Si le système de filtres dynamiques de SeqOne permet de réduire cette liste à une sélection de variants pertinents dans le contexte d’une analyse, il peut être utile de mettre de côté ceux d’entre eux n’étant pas retenus pour le patient étudié, afin de ne pas y consacrer davantage de temps lors de l’interprétation.

C’est là l’idée derrière la fonctionnalité Déjà Vu, vous permettant de masquer sélectivement et de manière reversible certains variants lors de votre analyse.

Comment ça marche ?

Déjà vu repose sur la sélection d’un ou plusieurs variants à partir du tableau de variants, via un outil de sélection. 

Dès lors qu’au moins un variant est sélectionné, une icône apparaît dans l’en-ête du tableau, vous donnant la possibilité de masquer la sélection. Celle-ci devient alors grisée.

Utilisation de Déjà Vu pour masquer une sélecion de variants.

Cette action est reversible, par le biais d’une seconde icône vous permettant de faire réapparaître les variants souhaités.

Icônes permettant respectivement d’afficher (gauche) et de masquer (droite) une sélection de variants.

Exemple d’utilisation

Après avoir inspecté une première série de variants, suite à l’application d’un filtre par exemple, certains peuvent être rapidement sélectionnés et masqués. Une fois le filtre levé, ou remplacé par un autre, ces variants apparaitront toujours grisés, de sorte d’éviter de s’y attarder à nouveau.

Si votre sélection de variants s’étend sur plusieurs pages du tableau de variants, seule la sélection visible sur la page en cours sera masquée, afin d’éviter tout risque d’erreur.

Contrairement à l’outil VKB, la sélection de variants annotés “déjà vus” est restreinte à l’analyse en cours, et est entièrement reversible.

Configurez votre tableau de variants

Sélectionnez les colonnes d’annotations souhaitées depuis l’onglet dédié, et enregistrez vos profils de colonnes personnalisés pour chaque type d’analyse.

Newlsetter octobre 2020

Nouveau système de gestion des colonnes

En plus du jeu de colonnes affiché par défaut dans votre tableau de variants, de nombreux éléments d’annotations et informations peuvent y être ajoutés sous la forme de colones supplémentaires.

Il suffit pour cela de dérouler la liste des rubriques disponibles à partir de l’encart Columns, localisé à gauche du tableau.

Menu de configuration des colonnes dans le tableau de variants

Les colonnes ainsi sélectionnées persisteront d’une analyse à l’autre, pour toute la durée de votre session.

Enregistrer un profil de colonnes

La configuration sélectionnée pour votre tableau de variants peut désormais être enregistrée, afin que celle-ci ne soit plus réinitialisée à chaque déconnexion.

Ce nouveau système fonctionne d’une manière analogue aux profils de filtres : après avoir déroulé le menu de sélection des colonnes, coché ou décoché les colonnes souhaitées, le profil correspondant peut être enregistré via le menu déroulant Select profile.

Le profil ainsi créé devient alors disponible dans ce menu, applicable d’un simple clic, et peut être réinitialisé à tout moment :

Appliquer un profil de colonnes enregistré

Des profils de colonnes spécifiques selon le type d’analyse

De la même manière que pour les filtres, le profils de colonnes enregistrés sont propres à un type d’analyse : SomaVar, GermlineVar, GermlineFamily, etc.

Seuls les profils utilisables dans l’analyse en cours sont affichés par défaut,  dans la rubrique Personal profiles. Ceux générés à partir d’un type d’analyse différent, et incompatibles avec l’analyse en cours sont listés sous la rubrique Incompatible profiles, le nom du pipeline compatible s’affichant en survolant le profil avec la souris.

Analysez vos données d’RNA-seq ciblé

Nouveau pipeline pour l’analyse de données RNA-Seq ciblé (capture) avec recherche des gènes de fusion, mutations et analyse du splicing.

Newsletter Janvier 2020
Logo du workset
SomaRNA™

Contexte

Gènes hybrides formés de deux gènes précédemment indépendants, les gènes de fusion résultent de réarrangements chromosomiques tels que les translocations, les délétions ou encore les inversions.

Les transcrits résultants de ces réarrangements sont impliqués dans divers types de cancers [1], étant plus susceptibles de conduire à la production de protéines anormales. Ainsi, la plupart des gènes de fusion identifiés à ce jour sont associés à des cancers hématologiques, sarcomes mais aussi carcinomes [2]. Les identifier est donc un enjeu primordial dans l’identification de cibles thérapeutiques.

Par exemple, les fusions de gènes codant pour des tyrosines kinases représentent une classe importante d’oncogènes associés aux tumeurs hématologiques et solides. Ils sont produits par des translocations et d’autres réarrangements chromosomiques d’un sous-ensemble de gènes de tyrosines kinases.  Il a été montré que les inhibiteurs de tyrosine kinase étaient particulièrement efficaces dans le traitement de ces types de cancers [3].

Nouveautés

Nous avons créé SomaRNA, un outil dédié à l’analyse de données de RNA-seq issues d’approches ciblées de type capture, permettant entre autres d’identifier et visualiser les événements de fusions de gènes à l’échelle du transcrit, tout en détectant SNV et indels.

Ce dernier est disponible au lancement d’une analyse si le type de données du projet a été défini comme ARN à sa création.

Comment ça marche ?

La détection et la visualisation des fusions par SomaRNA repose sur la combinaison de deux outils :

  • STAR, un aligneur de données RNA-seq conçu pour l’alignement de séquences non contiguës directement sur le génome de référence [4] ,
  • Arriba, qui détecte les fusions de gènes à partir d’alignements chimériques [5].

A partir des alignements chimériques issues de STAR, Arriba applique un ensemble de filtres pour éliminer les artéfacts connus et les transcrits observés en contexte non-pathologique. Il associe à chaque événement de fusion potentiel un score de confiance, lequel dépend de multiples critères :

  • le nombre de séquences supportant la fusion,
  • l’équilibre entre les split reads et les paires de reads discordantes,
  • la distance entre les breakpoints, leur position (intragénique ou non),
  • le type d’événement.

Le résultat final est une liste de prédictions de fusions, que l’interface propose sous la forme de différents onglets :

Informations générales sur la fusion, telles que le nombre de spanning reads couvrant la fusion, sa nature (translocation, duplication, inversion or délétion) et son impact sur le cadre de lecture.

Informations relatives aux partenaires, avec les symboles des gènes impliqués dans l’événement de fusion et, pour chacun, les exons impliqués à l’échelle du transcrit ainsi que les coordonnées génomiques du point de fusion.

Représentations graphiques de la fusion, aussi bien à l’échelle du gène et de l’exon, que de la protéine. 

Un premier onglet présente la structure de la fusion et les partenaires impliqués, la couverture des exons couverts par le manifeste de l’analyse étant représentée sous la forme d’un diagramme sur fond jaune :

Les domaines protéiques conservés à l’issue de la fusion  sont mis en évidence dans une seconde vue, pour permettre l’identification de cibles thérapeutiques potentielles :

Autres fonctionnalités

SomaRNA contient une étape de détection des variants à l’issue de l’alignement de STAR, via le variant caller Freebayes.

A l’instar des worksets SomaVar et GermlineVar, ces variants sont ensuite annotés et rendus disponibles dans un onglet Variants.

A venir 

Cette première itération du workset ARN sera bientôt complémentée par des modules dédiés à l’expression ainsi qu’à la détection des sites d’épissage alternatifs.

Durant la phase beta de cette fonctionnalité, n’hésitez-pas à nous faire part de vos retours par mail à l’adresse support@seqone.com.

Biblioraphie

[1] Yoshihara, K., Wang, Q., Torres-Garcia, W., Zheng, S., Vegesna, R., Kim, H., and Verhaak, R.G.W. (2015). The landscape and therapeutic relevance of cancer-associated transcript fusions. Oncogene 34, 4845–4854.

[2] Mitelman, F., Johansson, B., and Mertens, F. (2007). The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nat. Rev. Cancer 7, 233–245.

[3] Medves, S., and Demoulin, J.-B. (2012). Tyrosine kinase gene fusions in cancer: translating mechanisms into targeted therapies. J. Cell. Mol. Med. 16, 237–248.

[4] Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, Drenkow J, Zaleski C, Jha S, Batut P, Chaisson M, Gingeras TR. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 2013;29:15–21

[5] https://github.com/suhrig/arriba